ABSTRAK
Urutan genom lengkap A. dauci DSM 28700, A. fastidiosus KKP 3000 (penghasil guaiakol), dan A. fastidiosus DSM 17978 (bukan penghasil guaiakol) ditentukan terlebih dahulu. Kemudian, keberadaan gugus gen biosintesis guaiakol dalam urutan genom 7 galur Alicyclobacillus penghasil guaiakol dan 16 galur Alicyclobacillus penghasil guaiakol diteliti. Dari 7 galur Alicyclobacillus penghasil guaiakol yang diteliti, gugus gen biosintesis guaiakol lengkap ditemukan pada A. fastidiosus K3000, A. acidiphilus NBRC 100859, A. dauci DSM 28700, A. suci VF-FSL-W10-0049 dan FSL-W10-0048; hanya gen guaB, guaC, guaD, dan guaE yang ditemukan pada A. herbarius DSM 13609, dan gen guaA, guaB, guaC, guaD, dan guaE ditemukan pada A. hesperidum subsp. aegles DSM 11985. Tidak ada klaster gen guaiacol lengkap yang hadir pada 16 penghasil Alicyclobacillus non-guaiacol yang diuji. Kinetika ekspresi gen dalam klaster gen biosintetik guaiacol dalam kondisi memproduksi dan tidak memproduksi guaiacol menunjukkan bahwa ekspresi 6 gen tersebut terkait erat dengan produksi guaiacol pada A. acidoterrestris. Temuan ini akan memfasilitasi pemahaman yang lebih dalam tentang produksi guaiacol pada Alicyclobacillus spp., yang akan berkontribusi untuk mengembangkan metode pengendalian yang efektif untuk meminimalkan pembusukan terkait Alicyclobacillus dalam industri jus buah.
1 Pendahuluan
Alicyclobacillus spp. adalah bakteri pembentuk spora dengan kemampuan tahan panas dan asam yang kuat (do Prado-Silva et al. 2024; Wahia et al. 2023). Karena isolat Alicyclobacillus berasal dari tanah, isolat tersebut dapat masuk ke dalam jalur produksi jus buah saat menggunakan buah mentah yang terkontaminasi tanah (Clotteau 2014). Galur ini dapat bertahan hidup dalam proses pasteurisasi dan menyebabkan jus buah yang dipasteurisasi menjadi rusak (Sokołowska et al. 2020; Sun et al. 2023). Kerusakan tersebut ditunjukkan dengan terbentuknya bau tidak sedap yang berasal dari obat atau antiseptik yang terutama disebabkan oleh guaiakol, yang dapat dideteksi melalui cara sensorik dalam jus buah pada kadar 2 μg/L (Roth et al. 2023; Sun et al. 2023). Telah dilaporkan bahwa tidak semua Alicyclobacillus spp. mampu menghasilkan guaiakol. Spesies yang diketahui menghasilkan guaiakol adalah A. acidoterrestris, A. herbarius, A. acidiphilus, A. suci, A. dauci, A. fastidiosus, dan A. hesperidum subsp. aegles, dan khususnya, A. acidoterrestris merupakan penyebab utama pembusukan pada minuman asam (Goto et al. 2023; Połaska et al. 2021; Roth et al. 2021; Yokota et al. 2008).
Untuk galur A. acidoterrestris, guaiakol diproduksi melalui dekarboksilasi non-oksidatif asam vanilat oleh dekarboksilase asam vanilat (Rui Cai et al. 2015). Enzim ini dikodekan oleh gugus gen dekarboksilase asam vanilat (vdc), yang terdiri dari tiga gen, vdcB, vdcC, dan vdcD (Thi Song Van et al. 2021; Wang et al. 2021). Studi transkriptomik dan proteomik terkini kami menemukan bahwa selain gen vdcBCD, dua gen hulu (protein transpor membran benzoat dan pengatur transkripsi tipe LysR) dan satu gen hilir (protein famili piridoksamin 5′-fosfat oksidase) juga mengalami peningkatan regulasi secara signifikan dalam proses produksi guaiakol (Wang et al. 2021). Klaster gen biosintesis guaiakol pada A. acidoterrestris seharusnya terdiri dari enam gen, termasuk satu gen yang mengkode transporter (dinamakan gua (guaiakol) A), satu gen yang mengkode regulator transkripsi famili LysR (dinamakan guaB), tiga gen yang mengkode subunit dekarboksilase asam vanilat (dinamakan guaC, guaD, dan guaE selama penelitian ini), dan satu gen yang mengkode protein famili piridoksin 5′-fosfat oksidase (dinamakan guaF). Akan tetapi, apakah klaster gen ini merupakan penentu genetik produksi guaiakol pada Alicyclobacillus spp. belum diselidiki.
Dalam penelitian ini, seluruh urutan genom dari dua galur penghasil guaiakol Alicyclobacillus (A. dauci DSM 28700 dan A. fastidiosus KKP 3000) dan satu galur yang tidak menghasilkan guaiakol (A. fastidiosus DSM 17978) pertama-tama ditentukan. Kemudian, keberadaan gugus gen biosintetik guaiacol dalam urutan genom 7 produsen Alicyclobacillus guaiacol dan 16 produsen non-guaiacol dieksplorasi. Hubungan antara ekspresi gen dalam gugus gen biosintetik guaiacol dan produksi guaiacol dalam A. acidoterrestris juga diselidiki.
2 Bahan dan Metode
2.1 Strain Bakteri dan Kondisi Pertumbuhan
Strain A. acidoterrestris DSM 3922, A. dauci DSM 28700, dan A. fastidiosus DSM 17978 diperoleh dari Koleksi Mikroorganisme dan Kultur Sel Jerman dan A. fastidiosus KKP 3000 diperoleh dalam bentuk beku-kering dari Institut Pertanian dan Bioteknologi Pangan Polandia. Bubuk beku-kering dikultur dalam medium A. acidocaldarius (AAM) (Yamazaki et al. 1996). Kultur yang diperoleh digoreskan ke dalam lempeng agar AAM dan diinkubasi pada suhu 45°C selama 48 jam, kemudian satu koloni dipindahkan ke dalam medium cair AAM dan diinkubasi pada suhu 45°C selama 16 jam untuk memperoleh kultur segar.
2.5 Produksi Guaiakol oleh A. acidoterrestris
Kultur segar DSM 3922 (1 mL) diinokulasi ke dalam medium AAM 100 mL dan diinkubasi pada pengocok putar pada kecepatan 150 rpm pada suhu 45°C hingga sel berada dalam periode pertumbuhan logaritmik (sekitar 16 jam). Asam vanilat dilarutkan dalam etanol 50% (v/v) hingga mencapai konsentrasi 0,25 mol/L, kemudian ditambahkan ke larutan kultur DSM 3922 hingga mencapai konsentrasi akhir 500 μmol/L. Campuran disimpan pada suhu 45°C dengan pengocokan pada kecepatan 150 rpm. Sampel dikumpulkan pada menit ke-5, 15, 30, 45, 60, 75, dan 90, dan dianalisis untuk konsumsi asam vanilat dan produksi guaiakol menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) yang telah kami laporkan sebelumnya (Rui Cai et al. 2015). Ekspresi gen dalam gugus gen biosintesis guaiakol dianalisis dengan metode RT-qPCR. Sel DSM 3922 tanpa penambahan asam vanilat digunakan sebagai kontrol. Percobaan dilakukan tiga kali menggunakan kultur independen. 2.6 Analisis Ekspresi Gen dalam Gugus Gen Biosintetik Guaiacol pada A. acidoterrestris
Karena gen referensi internal (RG) yang diekspresikan secara stabil sangat penting dalam analisis RT-qPCR, RG diidentifikasi berdasarkan data transkriptom sampel A. acidoterrestris dengan dan tanpa penambahan asam vanilat (Wang et al. 2021). Koefisien variasi (CV, %) dan nilai perubahan lipatan maksimum (MFC) berdasarkan fragmen per kilobase transkrip per juta pembacaan yang dipetakan (FPKM) untuk setiap gen dalam setiap sampel dihitung menggunakan Microsoft Excel. Situs web pencari gen pola (PaGeFinder) digunakan untuk menentukan ukuran dispersi (DPM) (Pan et al. 2012). Nilai DPM yang mendekati 0 menunjukkan bahwa tingkat ekspresi gen serupa di semua sampel RNA-seq, dan ekspresinya stabil terlepas dari perlakuan. Akhirnya, gen yang sesuai beserta CV rendah (CV < 0,1), MFC rendah (MFC < 1,5), tingkat ekspresi yang dapat diterima (10 < FPKM < 1000), dan DPM rendah (DPM < 0,1) dipilih sebagai RG (Song et al. 2021; Zhao et al. 2021).
Pasangan primer spesifik untuk RG potensial dan gen target dirancang menggunakan perangkat lunak Primer Premier (v5.0) dan tercantum dalam Tabel 2. Prosedur ekstraksi RNA dan analisis RT-qPCR dilakukan seperti yang kami laporkan sebelumnya (Wang et al. 2021). Untuk mengevaluasi tingkat ekspresi RG potensial, nilai ambang siklus (Ct) digunakan. Stabilitas ekspresi RG potensial dikonfirmasi menggunakan tiga metode statistik: geNorm (Vandesompele et al. 2002), BestKeeper (Pfaffl et al. 2004), dan NormFinder (Andersen et al. 2004). Terakhir, RefFinder digunakan untuk memverifikasi bahwa ketiga pendekatan tersebut bekerja secara efektif dan untuk memeringkat RG dari data secara lengkap (Xie et al. 2012). Setelah RG yang tepat dipilih, sampel cDNA dianalisis untuk mengetahui kelimpahan enam gen dalam klaster gen biosintesis guaiacol. Teknik 2−ΔΔCt diadopsi untuk menentukan tingkat ekspresi relatif dari enam gen (Hellemans et al. 2007).
Tabel 2. Informasi primer yang digunakan untuk RT-qPCR.
2.7 Analisis Statistik
Setiap pengujian diulang setidaknya tiga kali. Data dinyatakan sebagai mean ± standard deviation (SD) dan dianalisis oleh Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, v19.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA) untuk analisis varians satu arah dan uji rentang berganda Duncan. Interval kepercayaan adalah 95% (p < 0,05).
3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Pengurutan, Perakitan, dan Karakterisasi Genom
Untuk menganalisis secara komprehensif dan sistematis mekanisme molekuler produksi guaiakol pada Alicyclobacillus pada tingkat genomik, platform pengurutan DNBSEQ dan Nanopore digunakan untuk memperoleh urutan genom lengkap A. dauci DSM 28700, A. fastidiosus DSM 17978, dan A. fastidiosus KKP 3000 dan semua data pengurutan yang diperoleh juga diunggah ke basis data NCBI. Galur DSM 28700 diisolasi dari produk jus buah dan sayur campuran yang rusak dan dapat menghasilkan guaiakol dari asam vanilat (Nakano et al. 2015). Galur referensi DSM 17978 diisolasi dari sari apel dan tidak menunjukkan produksi guaiakol, sedangkan galur KKP 3000 yang diisolasi dari kebun buah di Polandia mampu menghasilkan guaiakol (Goto et al. 2007; Połaska et al. 2021).
Genom lengkap DSM 28700 terungkap terdiri dari kromosom (4.632.428 bp, kandungan GC 50,43%, nomor akses CP104064) serta dua plasmid (148.985 bp, kandungan GC 49,48%, nomor akses CP104065; 99.745 bp, kandungan GC 45,45%, nomor akses CP104066; Informasi Pendukung S1: Gambar S2). Genom DSM 17978 terdiri dari kromosom 5.722.397 kb (kandungan GC 51,59%, nomor akses CP104067) dan tiga plasmid (204.939 bp, kandungan GC 46,38%, nomor akses CP104068; 68.553 bp, kandungan GC 45,71%, nomor akses CP104069; 39.760 bp, kandungan GC 36,44%, nomor akses CP104070; Informasi Pendukung S1: Gambar S3). Sementara genom KKP 3000 hanya terdiri dari satu kromosom sirkuler sepanjang 4.968.037 bp dengan kandungan GC 52,98% (nomor akses CP119138) (Gambar 1 dan Tabel 3). Pada ketiga genom lengkap ini, jumlah gen yang teridentifikasi masing-masing adalah 5060, 6343, dan 5096. Analisis fungsional lebih lanjut dari gen-gen ini dalam DSM 28700 menunjukkan bahwa 3055 (60,37%), 2717 (53,69%), dan 2639 (52,15%) gen dapat ditemukan melalui informasi anotasi dalam basis data COG, GO, dan KEGG. Nilai yang sesuai untuk DSM 17978 adalah 3564 (56,18%), 3296 (51,96%), dan 3042 (47,95%), dan untuk KKP 3000 adalah 3101 (60,85%), 2789 (54,72%), dan 2678 (52,55%).
3.2 Keberadaan Gugus Gen Biosintetik Guaiacol pada Alicyclobacillus Spp
Di antara tujuh penghasil Alicyclobacillus guaiacol, gugus gen biosintetik guaiacol yang lengkap ditemukan pada K3000, NBRC 100859, DSM 28700, VF-FSL-W10-0049, dan FSL-W10-0048, tetapi terdapat beberapa perbedaan dalam urutan, posisi, dan arah gen dalam gugus gen di antara galur yang berbeda (Gambar 2). Susunan gugus gen pada VF-FSL-W10-0049 dan FSL-W10-0048 serupa dengan yang ada pada DSM 3922; pada KKP 3000 arah gugus gen berlawanan; pada NBRC 100859 dan DSM 28700, gen guaA tidak berdekatan dengan gen lain dalam gugus gen. Menariknya, kecuali satu klaster gen guaiacol yang lengkap, homolog berklaster lain dari guaD dan guaE ditemukan di VF-FSL-W10-0049 dan FSL-W10-0048, dan tiga homolog guaDE berklaster lainnya ditemukan di KKP 3000 (Tabel 4). Sementara pada dua produsen guaiacol lainnya, hanya gen guaB, guaC, guaD, dan guaE yang ditemukan di DSM 13609, dan gen guaA, guaB, guaC, guaD, dan guaE ditemukan di DSM 11985 (Gambar 2). Tidak adanya gen guaA mengindikasikan bahwa mungkin ada beberapa protein transpor lain yang terlibat dalam pengangkutan asam vanilat, guaiakol, dan karbon dioksida dalam DSM 13609. Oksidase piridoksinamina 5′-fosfat mengkatalisis oksidasi piridoksina 5′-fosfat atau piridoksamina 5′-fosfat untuk membentuk piridoksal 5′-fosfat (PLP) (Domitrovic et al. 2015). Gen guaF tidak ada dalam DSM 13609 dan DSM 11985 mengindikasikan bahwa dekarboksilase asam vanilat dari kedua galur ini tidak memerlukan PLP sebagai kofaktor untuk aktivitas katalitik.
Kirim masukanPanel samping Histori Tersimpan.
Tidak ada gugus gen lengkap yang hadir dalam 16 penghasil Alicyclobacillus non-guaiacol yang diuji. Secara khusus, tidak ada sekuens gen yang terkait dengan gugus gen biosintesis guaiacol yang ditemukan dalam DSM 446, DSM 17975, NBRC 103104, DSM 14955, NBRC 100866, FSL-W10-0057, dan FSL-W10-0059. Gen guaA ditemukan dalam DSM 17974, DSM 12489, dan DSM 12766. Sedangkan untuk galur DSM 17978, guaA dan 2 gen guaDE yang terkelompok telah diidentifikasi (Tabel 4). Perlu disebutkan bahwa beberapa homolog guaC (identitas dari 62% hingga 64%), yang diberi anotasi sebagai flavin prenyltransferase famili UbiX, ditemukan dalam DSM 4006, FSL-W10-0018 dan FSL-W10-0037, DSM 17980, NBRC 103103, DSM 17978, DSM 3922, VF-FSL-W10-0049 dan FSL-W10-0048, DSM 28700, dan K3000 (Tabel 4). UbiX menghasilkan flavin mononukleotida terprenilasi (FMN) yang berfungsi sebagai kofaktor untuk (de)karboksilase UbiD. Di satu sisi, tampaknya tidak ada hubungan langsung antara keberadaan ubiX dan pembentukan guaiakol. Di sisi lain, sebelumnya telah ditunjukkan bahwa dekarboksilase asam vanilat dari strain Streptomyces sp. D7 memerlukan ketiga gen (gua CDE) untuk aktivitas penuh ketika dikloning dan diekspresikan dalam Streptomyces lividans 1326 (Chow et al. 1999); namun, ketika dikloning dan diekspresikan dalam E. coli K-12, hanya dua produk gen (GuaDE) yang cukup untuk aktivitas (Lupa et al. 2005). Kemungkinan besar dalam E. coli K-12, produk gen C yang hilang dapat digantikan oleh protein lain, yang berpotensi UbiX untuk menghasilkan aktivitas enzim. UbiX yang berasal dari E. coli K-12 menunjukkan 57% identitas dengan Streptomyces sp. D7 GuaC. Dalam DSM 17978, terdapat homolog guaC yang sesuai (63% dan 62% identitas, berkorespondensi dengan gen ubiX) yang terletak di hilir dan berdekatan dengan setiap gen guaDE, dan juga regulator transkripsi tipe LysR yang terletak di hulu guaDE (38% dan 37% identitas dengan guaB dari DSM 3922) (Tabel 4), tetapi galur ini tidak menghasilkan guaiakol. Salah satu alasannya mungkin karena urutan gen guaC, guaD, dan guaE menentukan aktivitas enzim, karena gugus gen dekarboksilase asam vanilat yang dilaporkan saat ini semuanya berbentuk guaCDE (Lupa et al. 2005; Lupa et al. 2008; Połaska et al. 2021), sementara dalam DSM 17978 guaC terletak di hilir guaDE. Alasan lainnya mungkin karena DSM 17978 memerlukan keberadaan gen lain dalam gugus gen selain guaBCDE untuk menghasilkan guaiacol, karena baik galur DSM 17978 maupun KKP 3000 termasuk dalam A. fastidiosus, dan gugus gen yang lengkap ditemukan pada penghasil guaiacol KKP 3000.
Guaiacol diproduksi oleh Alicyclobacillus spp. dari vanilin dan asam vanilat dalam sari buah (Rui Cai et al. 2015). Secara khusus, vanilin awalnya dioksidasi menjadi asam vanilat oleh dehidrogenase vanilat yang bergantung pada NAD(P)+ dan asam vanilat selanjutnya didekarboksilasi secara non-oksidatif menjadi guaiacol oleh dekarboksilase asam vanilat (R. Cai et al. 2016). Tingkat produksi guaiakol dipengaruhi oleh berbagai faktor ekstrinsik, seperti komposisi media kultur, pH, konsentrasi oksigen, suhu pertumbuhan, dan spesies atau galur (Rui Cai et al. 2019; Chang et al. 2015; Ulfadillah dan Chang 2024). Namun, bagaimana faktor intrinsik memengaruhi produksi guaiakol oleh Alicyclobacillus spp. masih belum jelas. Dalam penelitian ini, penentu genetik produksi guaiakol pada Alicyclobacillus spp. diteliti untuk lebih memahami mengapa pembentukan guaiakol terbatas pada beberapa Alicyclobacillus. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa gen guaB, guaC, guaD, dan guaE terdapat pada semua galur penghasil guaiakol Alicyclobacillus, yang menunjukkan bahwa gen-gen ini penting untuk produksi guaiakol. 3.3 Pemilihan Kandidat RG
Dalam kondisi penyaringan 10 < FPKM < 1000, CV < 0,1, DPM < 0,1, dan MFC < 1,5, total 247 gen disaring. Kemudian, tujuh gen [acrC (protein famili dehidrogenase asil-CoA), ItaE (l-threonine aldolase dengan spesifisitas rendah), sufB (protein perakitan kluster Fe-S), yuzB (protein yang mengandung domain DUF1450), rhaB (rhamnulokinase), ywbO (oksidoreduktase famili DsbA), dan rarD (transporter famili DMT)] dengan nilai CV yang relatif lebih rendah dipilih sebagai kandidat RG (Informasi Pendukung S1: Tabel S2). Selain itu, tiga RG lain yang umum digunakan [16S rRNA, rpoB (subunit RNA polimerase B) dan gyrA (subunit DNA girase A)] untuk mengeksplorasi ekspresi gen target pada bakteri juga disertakan (L. Liu et al. 2022; Patole et al. 2021; Rocha et al. 2015; Zhao et al. 2021). Untuk masing-masing dari 10 gen yang dipilih, kurva peleburan bersifat unimodal, membuktikan bahwa tidak ada dimer primer atau produk amplifikasi PCR non-spesifik yang terbentuk (Informasi Pendukung S1: Gambar S4). Analisis kurva standar dari 10 kandidat RG menunjukkan bahwa R2 berkisar dari 0,9922 (rpoB) hingga 0,9998 (rarD), dan nilai E berkisar dari 95% (araC) hingga 108,93% (yuzB) (Informasi Pendukung S1: Gambar S5). Hasilnya menunjukkan bahwa setiap pasangan primer memiliki spesifisitas dan efisiensi amplifikasi yang tinggi dan dapat digunakan untuk analisis RT-qPCR lebih lanjut. Tingkat ekspresi RG kandidat dapat dievaluasi dengan
Stabilitas ekspresi setiap RG ditentukan menggunakan tiga algoritma berbeda (geNorm, NormFinder, dan BestKeeper), dan alat yang komprehensif (RefFinder). Nilai stabilitas (nilai M) dari 10 RG potensial dihitung oleh geNorm (semakin besar nilai M, semakin rendah kestabilan gen tersebut), dan M = 1,5 digunakan sebagai ambang batas default untuk menilai stabilitas RG (Yao et al. 2022). Empat RG kandidat dengan stabilitas terbaik adalah rpoB (0,588), rhaB (0,588), su0fB (0,664), ywbO (0,726), dan dua RG dengan stabilitas terendah adalah rarD (1,138) dan yuzB (1,304) (Gambar 3B). Algoritme geNorm menganalisis variasi berpasangan (Vn/n+1) antara dua faktor normalisasi berurutan NFn dan NFn+1 dalam pendekatan langkah demi langkah untuk menentukan jumlah RG yang ideal. Ketika Vn/n+1 kurang dari 0,15, RG yang dibutuhkan berada pada nilai minimum n (Vandesompele et al. 2002). Nilai V2/3 dari semua sampel yang diolah kurang dari ambang batas 0,15, yang menunjukkan bahwa tidak perlu memperkenalkan RG ketiga (Gambar 3C). Dengan demikian, dua RG akhirnya dipilih untuk standarisasi data berikutnya.
Untuk setiap RG yang mungkin, NormFinder mempertimbangkan fluktuasi ekspresi intragrup dan intergrup untuk menentukan nilai stabilitas, dan algoritme ini dapat mencegah kesalahpahaman yang disebabkan oleh gen yang diatur bersama (Bai et al. 2020). Skor stabilitas ekspresi yang rendah menunjukkan adanya gen dengan ekspresi yang stabil (Zhu et al. 2021). Stabilitas yuzB (1,821) adalah yang terburuk, dan rhaB (0,156), rpoB (0,300), dan ywbO (0,394) adalah tiga gen dengan stabilitas ekspresi tertinggi (Gambar 3D). Ketiga gen ini juga merupakan yang paling stabil dalam algoritma geNorm. Program Bestkeeper mengukur stabilitas RG berdasarkan nilai SD dan CV. Gen referensi relevan dengan CV ± SD terendah dapat diidentifikasi sebagai yang paling stabil, dan gen dengan nilai SD lebih besar dari 1 dinyatakan tidak layak untuk digunakan sebagai RG (Wang et al. 2019). Seperti yang dapat dilihat dari Gambar 3E, ywbO, rhaB, dan rpoB adalah tiga gen dengan stabilitas ekspresi yang lebih baik; yuzB (1,45) dan rarD (1,12) secara teoritis tidak dapat berfungsi sebagai RG. Algoritme RefFinder juga digunakan untuk memberi peringkat RG kandidat secara komprehensif guna menghindari hasil yang tidak konsisten yang diberikan oleh teknik tunggal (Xie et al. 2012). Tiga RG paling stabil adalah rhaB (1,19), rpoB (1,86), dan ywbO (2,45), sedangkan tiga RG paling tidak stabil adalah 16S rRNA (8,00), rarD (9,00), dan yuzB (10,00) (Gambar 3F). Menurut pedoman informasi minimum untuk publikasi eksperimen PCR kuantitatif waktu nyata (MIQE), normalisasi yang ditetapkan pada satu RG tidak diinginkan, dan jumlah RG yang paling sempurna perlu ditemukan secara empiris (Bustin et al. 2009). Hasil algoritme geNorm menunjukkan bahwa dua gen akan memadai untuk menormalkan ekspresi gen, mengingat nilai V2/3 berada di bawah ambang batas 1,5. Oleh karena itu, rhaB dan rpoB dipilih sebagai RG ganda yang ideal untuk analisis ekspresi gen dalam klaster gen biosintetik guaiacol. RhaB mengkode rhamnulokinase, yang dapat mentransfer gugus yang mengandung fosfor (Hirooka et al. 2015). rpoB mengkode subunit beta RNA polimerase yang diarahkan DNA, yang terlibat dalam transkripsi DNA (X. M. Liu et al. 2021). Untuk A. acidoterrestris, sebagian besar penelitian terkini tentang ekspresi gen fungsional menggunakan 16S rRNA sebagai RG untuk menormalkan data RT-qPCR (Feng et al. 2019; Jiao et al. 2015). Zhao et al. (2021) melaporkan bahwa 16S rRNA dari A. acidoterrestris tidak diekspresikan secara stabil dalam kondisi asam dengan nilai pH 2,5 hingga 4,0, sementara dnaG dapat digunakan sebagai RG yang sesuai untuk menormalkan ekspresi gen dalam stres asam. Hasil ini juga menyiratkan perlunya validasi RG di bawah perlakuan eksperimen tertentu.
3.4 Hubungan Antara Produksi Guaiacol dan Ekspresi Gen dalam Gugus Gen Biosintetik Guaiacol
Semua primer yang digunakan untuk keenam gen memiliki efisiensi amplifikasi yang tinggi dan spesifisitas amplifikasi yang baik (Informasi Pendukung S1: Gambar S6 dan S7). Setelah 5 menit penambahan asam vanilat ke dalam media kultur DSM 3922, sejumlah kecil guaiacol diproduksi dan ekspresi gen dalam gugus gen biosintetik guaiacol juga diaktifkan (Gambar 4). Dengan peningkatan produksi guaiacol, tingkat ekspresi gen dalam gugus gen meningkat secara signifikan. Di antara 6 gen dalam gugus gen guaiacol, guaC, guaD, dan guaE merupakan gen yang paling tinggi peningkatannya karena mereka mengkode dekarboksilase asam vanilat yang terlibat langsung dalam biosintesis guaiacol (Leonardo et al. 2022). Tingkat ekspresi gen guaC dan guaF mencapai maksimum pada menit ke-30 (tahap awal produksi guaiacol), sedangkan gen guaA, guaB, guaD, dan guaE mencapai maksimum pada menit ke-60–75 (tahap akhir produksi guaiacol). Dari menit ke-45 hingga menit ke-60, sejumlah besar guaiacol diproduksi dengan cepat dan perlu dikeluarkan dari sel, yang merangsang ekspresi guaA yang sangat meningkat, yang mengkode benzoat.
4 Kesimpulan
Di antara tujuh produsen Alicyclobacillus guaiacol, klaster gen biosintetik guaiacol lengkap ditemukan di K3000, NBRC 100859, DSM 28700, VF-FSL-W10-0049, dan FSL-W10-0048; hanya gen guaB, guaC, guaD, dan guaE yang ditemukan di DSM 13609, dan gen guaA, guaB, guaC, guaD, dan guaE ditemukan di DSM 11985. Tidak ada klaster gen guaiacol lengkap yang ada di 16 produsen Alicyclobacillus non-guaiacol yang diuji. Kinetika ekspresi gen dalam klaster gen biosintetik guaiacol di bawah kondisi memproduksi dan tidak memproduksi guaiacol menunjukkan hubungan yang signifikan antara ekspresi keenam gen dan produksi guaiacol di A. acidoterrestris. Dalam waktu dekat, eksperimen penghapusan gen akan diperlukan untuk lebih menentukan peran setiap gen dalam klaster gen dalam proses produksi guaiakol.
