ABSTRAK
Infeksi sitomegalovirus kongenital (cCMV) didiagnosis dengan tes urin atau air liur positif dalam waktu 21 hari setelah lahir. Di atas usia ini, PCR bercak darah kering (DBS) bayi baru lahir dapat mendiagnosis infeksi cCMV secara retrospektif tetapi memiliki sensitivitas yang lebih rendah daripada tes PCR urin atau air liur. PCR DBS mungkin negatif karena tidak adanya DNAemia darah saat lahir atau karena batas teknis deteksi untuk PCR DBS. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membedakan kedua kemungkinan ini dengan menentukan kesesuaian antara tes PCR DBS dan plasma CMV di antara bayi yang terinfeksi cCMV. Studi kohort retrospektif pusat tunggal ini mengevaluasi 70 bayi yang terinfeksi cCMV yang didiagnosis dengan PCR CMV urin positif, yang memiliki DBS CMV saat lahir dan tes PCR plasma dalam waktu 31 hari setelah lahir. Karakteristik klinis dan viral load dibandingkan antara kelompok menurut hasil PCR DBS dan plasma yang dipasangkan. Kesesuaian uji dihitung menggunakan koefisien kappa Cohen. Sensitivitas PCR DBS adalah 71% dibandingkan dengan PCR urin. Dari 70 subjek, 49 (70%) subjek adalah DBS+/plasma+, 1 (1,4%) adalah DBS+/plasma-, 14 (20%) adalah DBS-/plasma+, dan 6 (9%) adalah DBS-/plasma-. Kesepakatan antara tes tersebut cukup (κ = 0,348, 95% CI 0,115-0,581). Dari 20 subjek dengan tes DBS-, 6 (30%) memiliki DNAemia plasma yang tidak terdeteksi. Dari bayi dengan PCR DBS-/plasma+, viral load plasma secara signifikan lebih rendah daripada bayi dengan pengujian PCR DBS+/plasma+. Hampir sepertiga bayi yang terinfeksi cCMV mungkin terlewatkan oleh pengujian DBS karena keterbatasan biologis dan teknis dari metode ini. 1 Pendahuluan
Infeksi sitomegalovirus kongenital (cCMV) merupakan infeksi virus kongenital yang paling umum di AS, yang memengaruhi sekitar 1 dari 200 (0,5%) bayi yang lahir hidup [1, 2]. Di antara bayi baru lahir yang terinfeksi cCMV, 10–15% mengalami infeksi simtomatik saat lahir, di antaranya sekitar 40–58% akan mengalami disabilitas perkembangan saraf permanen termasuk gangguan pendengaran sensorineural (SNHL) [1, 2]. Selain itu, di antara 85–90% bayi yang tidak bergejala saat lahir, 13,5% akan mengalami keterlambatan perkembangan dan/atau SNHL yang muncul terlambat [1]. Beban sosial ekonomi infeksi cCMV cukup besar [3-5]. Pengobatan antivirus dapat meningkatkan hasil neurologis dan pendengaran [6, 7], tetapi bayi yang tidak bergejala dan bergejala ringan mungkin tidak teridentifikasi saat lahir jika tidak ada program skrining cCMV universal.
Diagnosis infeksi cCMV memerlukan pengujian PCR urin atau saliva positif atau kultur dalam 21 hari pertama setelah lahir [8]. Di atas usia 21 hari, tes positif mungkin disebabkan oleh infeksi CMV yang didapat pascanatal, yang umumnya ditularkan melalui pemberian ASI [9, 10]. Meskipun skrining bayi baru lahir universal dengan PCR urin atau saliva dapat mengidentifikasi infeksi cCMV dalam jangka waktu yang diperlukan, skrining universal tidak rutin dilakukan secara nasional di AS. Hambatan untuk skrining urin atau saliva universal meliputi biaya, waktu, pelatihan personel, potensi kesulitan mendapatkan spesimen urin yang dikemas, dan kebutuhan untuk menetapkan protokol untuk menindaklanjuti hasil positif untuk bayi yang dipulangkan sebelum pelaporan tes. Karena bercak darah kering neonatal (DBS) secara rutin diperoleh untuk program skrining bayi baru lahir negara bagian, ada minat yang cukup besar untuk menggunakan DBS untuk skrining infeksi cCMV karena kelayakan menggabungkan jenis sampel ini ke dalam alur kerja dan pelaporan program skrining negara bagian yang ada. Sejak Februari 2023, Minnesota menjadi negara bagian pertama di AS yang menerapkan skrining bayi baru lahir universal untuk infeksi cCMV menggunakan DBS [11], diikuti oleh New York dan beberapa provinsi Kanada. Selain itu, PCR DBS neonatal dapat digunakan untuk mengidentifikasi infeksi cCMV secara retrospektif di antara anak-anak yang didiagnosis dengan gangguan pendengaran sensorineural atau gejala neurologis setelah 21 hari setelah lahir.
Dua penelitian secara langsung membandingkan PCR DBS CMV dengan pengujian air liur dalam kelompok besar bayi baru lahir yang sehat (masing-masing n=20448 dan 12554) [12, 13]. PCR DBS dalam kedua penelitian ini memiliki sensitivitas yang sangat berbeda yaitu 34,4% dan 85,7% dibandingkan dengan kultur air liur cepat atau PCR. Perbedaan sensitivitas DBS antara kedua penelitian ini diduga sebagian disebabkan oleh perbedaan sensitivitas metode ekstraksi DBS dan PCR [13]. Akibatnya, telah diusulkan bahwa perbaikan teknis tambahan dalam sensitivitas uji DBS dapat memungkinkan penggunaannya sebagai metode skrining cCMV. Namun, tidak ada penelitian yang menguji darah dari venipuncture untuk PCR secara paralel dengan DBS untuk mengevaluasi kemungkinan bahwa PCR DBS negatif dapat mewakili negatif sejati yang disebabkan oleh tidak adanya DNAemia CMV pada beberapa bayi baru lahir yang terinfeksi cCMV. Mendukung premis ini, beberapa penelitian pada bayi dengan infeksi cCMV yang dikonfirmasi melaporkan bahwa 5–17% memiliki tes PCR darah negatif [14-17]. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membedakan keterbatasan teknis dalam metode DBS dari DBS negatif sejati (tidak adanya DNAemia) dengan menentukan kesesuaian antara tes DBS dan PCR plasma di antara bayi dengan diagnosis infeksi cCMV yang terbukti.
1 Karakteristik Kinerja PCR DBS
Berdasarkan definisi studi untuk infeksi cCMV, 100% bayi dalam kelompok ini memiliki hasil tes PCR urin positif. Dari 70 subjek, 50 memiliki PCR DBS positif, sehingga menghasilkan sensitivitas 71% dibandingkan dengan PCR urin. Semua 50 tes PCR DBS positif mendeteksi amplifikasi pada kedua replikasi sumur PCR untuk setiap sampel, dan semua 20 tes PCR DBS negatif tidak memiliki amplifikasi pada kedua replikasi sumur PCR. Membandingkan hasil PCR DBS dan plasma, 49 (70%) memiliki PCR DBS+/plasma+; 1 (1,4%) memiliki PCR DBS+/plasma−; 14 (20%) memiliki PCR DBS-/plasma+; dan 6 (9%) memiliki PCR DBS−/plasma− (Tabel 3). Kesepakatan antara pengujian cukup baik (κ = 0,348, interval kepercayaan 95%, 0,115–0,581). Tabel 1 menunjukkan distribusi jenis kelamin, ras, etnis, usia kehamilan, berat lahir, panjang lahir, lingkar kepala saat lahir, dan infeksi simtomatik untuk kelompok menurut hasil PCR plasma/DBS.
Mayoritas subjek (n = 55, 79%) memiliki pengujian DBS dan PCR plasma yang sesuai (+/+ atau −/−), yang mendukung bahwa pengujian DBS mencerminkan ada atau tidaknya DNAemia CMV pada subjek ini. Satu bayi (1,4%) memiliki PCR DBS positif dan PCR darah negatif. Sampel plasma subjek ini diperoleh pada 9 hari setelah lahir, yang berada di bawah usia rata-rata pada pengujian untuk kelompok DBS+/plasma+ (median [IQR], 13 hari [7,5–20,5]), yang menunjukkan bahwa tes plasma negatif bukan karena usia pascanatal subjek pada pengujian plasma. PCR DBS negatif pada 6 subjek (9%) karena DNAemia plasma yang tidak terdeteksi (plasma PCR-). Empat belas bayi (20%) memiliki PCR DBS negatif dan PCR plasma positif. Beban virus dalam plasma dibandingkan antara kelompok DBS+/plasma+ dan DBS-/plasma+ (Gambar 1A). Kelompok DBS−/plasma+ memiliki beban virus dalam plasma yang secara signifikan lebih rendah (321 IU/ml [IQR 165–464]) dibandingkan kelompok DBS+/plasma+ (2245 IU/ml [IQR 761–5773]) (p < 0,0001). Median usia pascanatal saat pengujian plasma serupa antara kelompok DBS+/plasma+ dan DBS−/plasma+, yang menunjukkan bahwa perbedaan beban virus antara kelompok-kelompok ini bukan disebabkan oleh perbedaan usia pascanatal saat pengujian plasma (Gambar 1B). Beban virus dalam setiap kelompok (DBS+/plasma+ atau DBS−/plasma+) selanjutnya dikelompokkan menurut usia pascanatal pada saat pengujian plasma (Tabel S2), yang mengonfirmasi bahwa beban virus secara statistik serupa di seluruh usia pascanatal dalam setiap kelompok. Dalam kelompok DBS+/plasma+ dan DBS−/plasma+, masing-masing 10 dari 49 subjek dan 5 dari 14 subjek tidak bergejala (p=0,27, tidak signifikan). Batas deteksi PCR DBS untuk bercak darah kering yang dicampur secara eksogen adalah 102–103 kopi/ml darah utuh. Semua ekstrak “kontrol” dari kertas saring kosong diuji negatif oleh PCR CMV..
2 Pembahasan
Dalam penelitian ini, terdapat kesesuaian yang wajar (κ) antara DBS dan PCR CMV plasma. Sensitivitas DBS kami sebesar 71% lebih rendah daripada tingkat 86% yang dilaporkan oleh Dollard et al. [13] tetapi lebih tinggi daripada yang dilaporkan dalam penelitian CHIMES (34%) [12]. Beberapa perbedaan ini dapat disebabkan oleh perbedaan dalam “standar emas” yang digunakan untuk menghitung sensitivitas. Penelitian kami membandingkan DBS dengan PCR urin, sedangkan kelompok Dollard membandingkan DBS dengan PCR saliva, yang menemukan bahwa pengujian saliva memiliki hasil positif palsu dan negatif palsu dibandingkan dengan PCR urin (masing-masing 13,3% dan 6,7%). Perbedaan antara penelitian kami dan CHIMES meliputi perbandingan DBS dengan PCR urin versus kultur saliva cepat, penggunaan luas permukaan DBS yang sedikit lebih besar per ekstraksi (18,84 vs. 14,13 mm2), ekstraksi manual versus otomatis, dan primer PCR dan kondisi siklus yang berbeda [12, 22, 23]. Perbedaan utama lainnya adalah bahwa studi CHIMES mengevaluasi kinerja uji dengan menyaring populasi besar bayi baru lahir yang sehat dan tidak dipilih. Tabel 4, bagian A, merangkum enam studi yang menggunakan PCR DBS untuk menyaring populasi bayi baru lahir untuk infeksi cCMV dan menemukan bahwa DBS positif untuk 0,12–0,48% bayi baru lahir [11-13, 24-26]. Sebaliknya, 6 studi yang menguji DBS pada anak-anak dengan infeksi cCMV yang diketahui (Tabel 2, bagian C) menemukan bahwa 6,7–86% subjek memiliki DBS positif [12, 13, 15, 27, 29, 30]. Studi kami lebih mirip dengan kelompok yang terakhir dengan mengevaluasi DBS di antara kelompok yang menjalani pengujian yang ditargetkan yang ditunjukkan oleh karakteristik klinis tertentu atau masuk NICU. Dalam kelompok kami, 77% memiliki infeksi simtomatik dan 39% memiliki keterlibatan SSP. Penelitian telah menunjukkan bahwa viral load dalam darah secara umum lebih tinggi pada bayi dengan infeksi simptomatik dibandingkan dengan infeksi asimtomatik [42-44] dan pada bayi dengan keterlibatan SSP [28], sehingga mungkin saja sensitivitas DBS yang tinggi pada penelitian kami hanya disebabkan oleh viral load yang tinggi Hasil kami menunjukkan bahwa PCR DBS lebih sering positif di antara anak-anak dengan viral load yang lebih tinggi tetapi mungkin negatif karena DNAemia yang rendah atau tidak ada. Sebuah penelitian kecil terhadap empat bayi yang terinfeksi cCMV menemukan bahwa keempatnya memiliki PCR plasma positif, tetapi hanya dua yang memiliki PCR DBS positif [27]. Baru-baru ini, dalam sebuah penelitian multisenter dari Spanyol, PCR DBS positif pada 58 dari 103 bayi yang terinfeksi cCMV (56%), PCR darah positif pada 82 dari 95 bayi (86%), dan DBS negatif dikaitkan dengan viral load darah yang rendah [15]. Kriteria inklusi untuk penelitian ini berbeda dari penelitian kami karena infeksi cCMV didiagnosis melalui PCR CMV positif atau kultur dari cairan tubuh apa pun (urin, darah, cairan serebrospinal) dalam 2 minggu pertama setelah lahir, dan tes PCR darah dilakukan di berbagai laboratorium klinis yang mungkin berbeda dari uji PCR yang digunakan untuk pengujian DBS.
Penelitian lain telah melaporkan viral load darah tanpa pengujian DBS bersamaan (Tabel 4, Bagian B). Dalam satu studi terhadap 20 neonatus yang terinfeksi cCMV dengan kultur urin CMV positif, 19 (95%) memiliki PCR serum positif, dengan 1 (5%) negatif [14]. Dalam studi lain terhadap 18 bayi dengan infeksi cCMV, 15 memiliki PCR darah positif tetapi tiga (17%) negatif [16]. Dalam kelompok yang lebih besar yang terdiri dari 256 bayi, 147 (92,5%) positif saat diagnosis tetapi 12 (7,5%) memiliki viral load darah negatif [17]. Studi-studi ini menunjukkan bahwa hingga 17% bayi yang terinfeksi cCMV tidak memiliki DNAemia CMV, dengan hasil kami (10%) setuju dalam kisaran ini. Tabel 4, bagian B dan C, merangkum studi pengujian PCR darah atau DBS untuk bayi yang terinfeksi cCMV, dengan PCR darah positif untuk 83–100% bayi yang terinfeksi cCMV, dan PCR DBS memiliki tingkat positif yang lebih rendah berkisar antara 6,7% hingga 86%. Secara bersamaan, data ini menunjukkan bahwa metode DBS mungkin gagal mengidentifikasi semua bayi yang terinfeksi cCMV, karena beberapa mungkin tidak mengalami DNAemia saat lahir.
Dalam penelitian lain, kinerja uji kartu Guthrie yang dicampur dengan darah dengan viral load yang diketahui dan berbagai metode ekstraksi/amplifikasi menghasilkan hasil PCR DBS positif yang tidak konsisten pada viral load darah antara 2 dan 4 log10 kopi/ml [22, 45]. Temuan ini sejalan dengan hasil kami yang menunjukkan bahwa DBS lebih jarang positif daripada sampel darah, dan bahwa DBS mungkin negatif di antara bayi dengan DNAemia tingkat rendah.
PCR DBS CMV yang ditargetkan telah digunakan untuk mengidentifikasi infeksi cCMV di antara neonatus yang gagal dalam skrining pendengaran bayi baru lahir (NBHS), tetapi pendekatan ini tidak mengidentifikasi banyak bayi yang terinfeksi cCMV yang lulus NBHS saat lahir [46]. Sampel urin dan air liur bayi baru lahir jarang tersedia secara retrospektif untuk mengonfirmasi infeksi cCMV di antara anak-anak yang mengalami SNHL setelah masa bayi baru lahir. Beberapa peneliti telah berupaya mendiagnosis infeksi cCMV pada anak-anak dengan SNHL yang muncul terlambat melalui pengujian PCR pada bercak darah kering yang dikumpulkan saat lahir untuk program skrining bayi baru lahir negara bagian, dengan hasil positif yang mendukung infeksi cCMV [29, 31-41]. Dalam penelitian ini, 2,7–34% subjek dengan SNHL positif DBS, yang mengonfirmasi infeksi cCMV pada anak-anak ini. Penelitian ini dirangkum dalam Tabel 4, bagian D. DBS juga diuji di antara kelompok yang terdiri dari 1.388 bayi dengan infeksi cCMV simptomatik atau berisiko terinfeksi cCMV, yang 7,5% di antaranya memiliki PCR DBS positif [30]. Singkatnya, PCR DBS dapat digunakan untuk membuat diagnosis retrospektif infeksi cCMV pada anak-anak dengan SNHL atau gejala infeksi cCMV lainnya, tetapi tes negatif tidak menyingkirkan infeksi cCMV.
Satu subjek dalam kelompok kami memiliki DBS positif dengan PCR darah negatif. Tidak jelas apakah hal ini disebabkan oleh tes PCR DBS positif palsu, atau apakah DNAemia sudah ada sejak lahir tetapi sudah sembuh sebelum pengujian plasma pada usia 9 hari. DBS positif palsu dapat terjadi melalui amplifikasi PCR positif palsu, amplifikasi karena kontaminasi laboratorium, atau mungkin dari kontaminasi silang CMV dari kartu DBS bayi yang tidak terinfeksi yang disimpan berdekatan dengan kartu DBS bayi yang terinfeksi cCMV [47, 48]. Kemungkinan amplifikasi positif palsu atau kontaminasi laboratorium dari spesimen DBS subjek ini rendah, karena kertas saring kosong “kontrol” yang diproses secara paralel menunjukkan hasil negatif melalui PCR. Potensi kontaminasi dari bercak darah kering yang berdekatan selama penyimpanan di Departemen Kesehatan Ohio tidak dapat dikesampingkan.
Keterbatasan penelitian ini meliputi ukuran sampel yang relatif kecil yang diperoleh dari pengujian yang ditargetkan dan sebagian besar terdiri dari bayi yang bergejala. Analisis juga dibatasi pada bayi yang terbukti terinfeksi cCMV dalam 21 hari pertama usianya, serta mereka yang telah menjalani pengujian PCR plasma dan sampel DBS yang tersedia untuk analisis. Hasil dari kelompok ini dapat berbeda dari populasi umum yang tidak dipilih yang disaring untuk infeksi cCMV. Ada kemungkinan juga bahwa beberapa bayi dengan hasil tes PCR plasma negatif mungkin mengalami DNAemia pada saat melahirkan tetapi sembuh dalam 31 hari pertama usianya. Namun, kemungkinan ini rendah, mengingat penelitian lain telah menunjukkan bahwa DNAemia CMV bertahan secara longitudinal selama berbulan-bulan hingga bertahun-tahun setelah infeksi kongenital [17, 49]pada kelompok simptomatik ini.
